Olink NextSeq 550 Preskúmajte sekvenovanie

Poznámka k dokumentu

Používateľská príručka Olink® Explore, dokument č. 1153, je zastaraná a bola nahradená nasledujúcimi dokumentmi:

• Olink® Explore Overview Používateľská príručka, dokument č. 1187
• Používateľská príručka Olink® Explore 384, dokument č. 1188
• Používateľská príručka Olink® Explore 4 x 384, dokument č. 1189
• Používateľská príručka Olink® Explore 1536 & Expansion, dokument č. 1190
• Používateľská príručka Olink® Explore 3072, dokument č. 1191
• Olink® Explore Sequencing using NextSeq 550 User Manual, doc nr 1192
• Olink® Explore Sequencing using NextSeq 2000 User Manual, doc nr 1193
• Olink® Explore Sequencing using NovaSeq 6000 User Manual, doc nr 1194

Úvod

Zamýšľané použitie

Olink® Explore je platforma multiplexného imunotestu na objavovanie biomarkerov ľudského proteínu. Produkt je určený len na výskumné použitie a nie na použitie pri diagnostických postupoch. Laboratórne práce môžu vykonávať iba vyškolení pracovníci laboratória. Spracovanie údajov môže vykonávať iba vyškolený personál. Výsledky sú určené na použitie výskumníkmi v spojení s inými klinickými alebo laboratórnymi nálezmi.

O tejto príručke

Táto používateľská príručka poskytuje pokyny potrebné na sekvenovanie knižníc Olink® Explore Libraries na Illumina® NextSeq™ 550. Pokyny sa musia striktne a jednoznačne dodržiavať. Akékoľvek odchýlky v priebehu laboratórnych krokov môžu viesť k zhoršeniu údajov. Pred spustením laboratórneho pracovného postupu si prečítajte Olink® Explore Overview Používateľská príručka pre úvod do platformy vrátane informácií o činidlách, potrebnom vybavení a dokumentáciiview pracovného postupu, ako aj laboratórnych smerníc. Pokyny, ako používať reagenčné súpravy Olink® Explore, nájdete v príslušnej používateľskej príručke Olink® Explore. Informácie o spracovaní údajov a analýze výsledkov sekvencie Olink® Explore nájdete v používateľskej príručke Olink® NPX Explore. Všetky ochranné známky a autorské práva obsiahnuté v tomto materiáli sú majetkom spoločnosti Olink® Proteomics AB, pokiaľ nie je uvedené inak.

Technická podpora

Pre technickú podporu kontaktujte Olink Proteomics na adrese podpora@olink.com.

Laboratórne pokyny

Táto kapitola poskytuje pokyny, ako sekvenovať knižnice Olink na NextSeq™ 550 pomocou NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cyklov). Protokol použitý na sekvenovanie je prispôsobením štandardného pracovného toku NGS Illumina® pre Illumina® NextSeq™ 550. Pred sekvenovaním sa uistite, že bola overená kvalita purifikovanej knižnice. Pokyny na kontrolu kvality nájdete v príslušnej používateľskej príručke Olink Explore.

Naplánujte si sekvenčný chod

Jedna knižnica Olink môže byť sekvenovaná na prietokovú kyvetu NextSeq™ 550 High Output a na jeden cyklus. Počet prietokových kyvet s vysokým výstupom a cyklov potrebných na sekvenovanie rôznych reagenčných súprav Olink Explore je popísaný v tabuľke 1. Ak je potrebný viac ako jeden cyklus, zopakujte pokyny popísané v tejto príručke.

Tabuľka 1. Plánovanie chodu sekvenovania

Reagenčná súprava Olink® Explore	Počet knižníc Olink	Počet prietokových buniek a cyklov
Reagenčná súprava Olink® Explore 384	1	1
Reagenčná súprava Olink® Explore 4 x 384	4	4
Reagenčná súprava Olink® Explore 1536	4	4
Súprava expanzných činidiel Olink® Explore	4	4
Reagenčná súprava Olink® Explore 3072	8	8

Nainštalujte si vlastný recept Olink®

Počas tohto kroku je na NextSeq™ 550 nainštalovaný vlastný recept Olink®. Tento krok je potrebné vykonať iba raz, a to pred prvým vykonaním sekvenčného cyklu Olink.

POZNÁMKA: Vlastný recept Olink bude fungovať iba so súpravami NextSeq™ 500/550 High Output Kit a riadiacim softvérom NextSeq™ 4.0.

1. Rozbaľte a umiestnite vlastný recept Olink Olink_NSQ550_HighOutput_V1 do nasledujúceho priečinka prístroja NextSeq™ 550: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
2. V časti Prispôsobenie systému > Spravovať nástroj povoľte vlastné recepty. Ak nie je vybratá, možnosť vlastného receptu sa počas nastavenia chodu nezobrazí.

POZNÁMKA

• Vo verzii softvéru NCS 4.0 sa možnosť výberu vlastného receptu objaví až po vložení kazety s činidlom, nie na predchádzajúcej stránke nastavenia.
• Spustenie musí byť nastavené v manuálnom režime, aby bolo možné vytvárať vlastné recepty.

Pripravte sekvenačné činidlá

Počas tohto kroku sa reagenčná kazeta obsahujúca klastrovacie a sekvenačné činidlá roztopí a pripraví sa prietoková kyveta.

Pripravte kazetu s činidlom

POZOR: Kazeta s činidlom obsahuje potenciálne nebezpečné chemikálie. Noste primerané ochranné prostriedky a použité reagencie zlikvidujte v súlade s platnými normami. Ďalšie informácie nájdete v príručke systému Illumina NextSeq 550 (dokument č. 15069765).

Pripravte lavicu

• 1x NextSeq™ 500/550 vysokovýkonná reagenčná kazeta v2 (75 cyklov).

Pokyny

1. Vložte kazetu s zmrazeným činidlom napoly ponorenú do vody ohriatej na teplotu miestnosti a nechajte ju rozmraziť 1 hodinu. Uistite sa, že všetky zásobníky reagenčných kaziet sú úplne rozmrazené.
   • POZNÁMKA: Pre pohodlie rozmrazte kazetu deň vopred a uskladnite ju cez noc pri teplote 4 °C. Pri tejto teplote sú činidlá stabilné až jeden týždeň.
2. Dôkladne osušte základňu kazety papierovou utierkou a v prípade potreby osušte fóliové tesnenia handričkou, ktorá nepúšťa vlákna.
3. Desaťkrát prevráťte kazetu, aby sa rozmrazené činidlá dôkladne premiešali.
4. Jemne poklepte náplňou o stôl, aby ste odstránili vzduchové bubliny. Ak sa kazeta použije do 4 hodín, skladujte ju pri izbovej teplote.

Pripravte prietokovú kyvetu

Pripravte lavicu

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5.

Pokyny

1. Vychladenú prietokovú kyvetu priveďte na izbovú teplotu na 30 minút.
2. Nasaďte si nové rukavice bez púdru (aby ste predišli kontaminácii skleneného povrchu prietokovej kyvety).
3. Keď budete pripravení vložiť prietokovú kyvetu do prístroja, vyberte prietokovú kyvetu z obalu a plastovú vložku.
4. Skontrolujte prietokovú kyvetu. Ak sú na niektorom zo sklenených povrchov viditeľné častice alebo prach, očistite príslušný povrch utierkou s izopropylalkoholom, ktorá nepúšťa vlákna a osušte ho laboratórnou vreckovkou s nízkym obsahom vlákien.

Pripravte Olink® Library na sekvenovanie

Počas tohto kroku sa pripravia riedenia NaOH a Tris-HCl a purifikovaná a kvalitatívne kontrolovaná knižnica Olink Library sa zriedi a denaturuje v postupných krokoch.

Pripravte riedenie NaOH

• Riedenie NaOH sa používa na denaturáciu knižníc.

Pripravte lavicu

• 1N zásobný roztok NaOH
• MilliQ voda
• 1x mikrocentrifugačná skúmavka (1.5 ml)
• Ručná pipeta (10–100 μl)
• Filtrujte špičky pipiet

Skôr ako začnete

• Skúmavku mikrocentrifúgy označte „0.2 N NaOH“.

Pokyny

1. Pripravte 0.2 N NaOH riedenie v 0.2 N NaOH skúmavke podľa tabuľky 2.
2. Skúmavku s 0.2 N NaOH dôkladne pretrepte a odstreďte. Spotrebujte do 12 hodín.

Tabuľka 2. Zriedenie 0.2 N NaOH

Činidlo	Objem (μl)
MilliQ voda	80
1N zásobný roztok NaOH	20

Pripravte riedenie Tris-HCl

• Tris-HCl riedenie sa používa na neutralizáciu denaturovanej knižnice.

Pripravte lavicu

• 1 M Tris-HCl pH 7.0 zásobný roztok (Trizma® hydrochloridový roztok)
• MilliQ voda
• 1x mikrocentrifugačná skúmavka (1.5 ml)
• Ručná pipeta (10–100 μl)
• Filtrujte špičky pipiet

Skôr ako začnete

• Skúmavku mikrocentrifúgy označte „Tris-HCl“

Pokyny

1. Pripravte 200 mM riedenie Tris-HCl v skúmavke Tris-HCl podľa tabuľky 3.
2. Skúmavku Tris-HCl dôkladne pretrepte na vortexe a odstreďte ju.

Tabuľka 3. 200 mM Tris-HCI riedenie

Činidlo	Objem (μl)
MilliQ voda	80
1M zásobný roztok Tris-HCl pH 7.0 (roztok hydrochloridu Trisma®)	20

Zrieďte knižnice Olink®

• Počas tohto kroku sa vyčistená knižnica Olink Library s kontrolovanou kvalitou zriedi v pomere 1:33.

Pripravte lavicu

• Lib Tube, pripravená podľa príslušnej používateľskej príručky Olink Explore
• MilliQ voda
• 1x mikrocentrifugačná skúmavka (1.5 ml)
• Ručné pipety (0.5–10 a 100–1000 μl)
• Filtrujte špičky pipiet

Skôr ako začnete

• Rozmrazte Lib Tube, ak je zmrazená.
• Označte novú mikrocentrifugačnú skúmavku: „Dil“.

Pokyny

1. Pridajte 96 μl vody MilliQ do skúmavky Dil.
2. Vortexujte Lib Tube a krátko ju otočte.
3. Preneste 3 μl z Lib Tube do Dil Tube.
4. Vortexujte Dil Tube a krátko ju otočte.

POZNÁMKA: Lib skúmavku(y) skladujte pri -20 °C pre prípad možného opätovného spustenia.

Denaturujte a zrieďte Olink® Library na konečnú nanášaciu koncentráciu

Počas tohto kroku sa zriedená knižnica Olink Library denaturuje a ďalej zriedi na konečnú nanášaciu koncentráciu.

Pripravte lavicu

• Dil Tube, pripravený v predchádzajúcom kroku
• 0.2 N riedenie NaOH, čerstvo pripravené v predchádzajúcom kroku
• 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) riedenie, pripravené v predchádzajúcom kroku
• Hybridizačný pufor 1 (HT1) je súčasťou balenia NextSeq™ Accessory Box v2
• 2x mikrocentrifugačné skúmavky (1.5 ml a 2 ml)
• Ručné pipety (0.5–10 a 100–1000 μl)
• Filtrujte špičky pipiet

Skôr ako začnete

• Zmrazený HT1 pufor rozmrazte pri izbovej teplote. Do použitia uchovávajte pri +4 °C.
• Označte novú 1.5 ml mikrocentrifugačnú skúmavku: „Den“ (pre denaturovanú knižnicu).
• Označte novú 2 ml mikrocentrifugačnú skúmavku: „Seq“ (pre knižnicu pripravenú na načítanie).

Pokyny

1. Preneste 5 μl z Dil Tube do Den Tube.
2. Pridajte 5 μl 0.2 N NaOH do dennej skúmavky.
3. Vortexujte Den Tube a krátko ju roztočte.
4. Inkubujte Den Tube 5 minút pri izbovej teplote, aby sa knižnica denaturovala.
5. Pridajte 5 μl 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) do skúmavky Den Tube, aby sa reakcia neutralizovala.
6. Vortexujte Den Tube a krátko ju roztočte.
7. Pridajte 985 μl predchladeného HT1 do Den Tube.
8. Vortexujte Den Tube a krátko ju roztočte. Skúmavku možno skladovať pri teplote +4 °C až do použitia (v ten istý deň).
9. Preneste 205 μl z Den Tube do Seq Tube.
10. Pridajte 1095 μl predchladeného HT1 do skúmavky Seq.
11. Obráťte skúmavku Seq, aby ste premiešali činidlá a krátko ju odstreďte. Konečný naložený objem je 1.3 ml.
12. Okamžite pokračujte krokom 2.5 Vykonajte sekvenovanie Olink®.

Vykonajte sekvenovanie Olink®

Počas tohto kroku sa kazeta s pufrom, prietoková kyveta a pripravená kazeta s činidlom obsahujúca knižnicu Olink Library vložia do NextSeq 550 a spustí sa sekvenovanie s použitím vlastného receptu Olink.

Pripravte lavicu

• Seq Tube (s knižnicou pripravenou na načítanie), pripravenou v predchádzajúcom kroku
• 1x NextSeq™ 500/550 vysokovýkonná reagenčná kazeta v2, pripravená v predchádzajúcom kroku
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, pripravený v predchádzajúcom kroku
• 1x zásobník NextSeq™ 500/550 Buffer Cartridge v2 (75 cyklov), pri izbovej teplote

Nastavte parametre chodu sekvenovania

Počas tohto kroku sa na NextSeq™ 550 vyberú parametre chodu sekvenovania.

1. Na domovskej obrazovke NextSeq™ 550 vyberte položku Experiment.
2. Na obrazovke Select Assay vyberte Sequence.
3. Na stránke Run Setup vyberte Manual run mode a potom Next.
4. Nastavte parametre chodu nasledovne:
   • Do poľa Run Name zadajte jedinečné ID experimentu.
   • Do poľa ID knižnice zadajte ID knižnice, ktorú prevádzkujete (voliteľné).
   • V poli Typ čítania vyberte možnosť Jedno čítanie.
   • Zadajte počet cyklov takto:
     • Prečítajte si 1: 24
     • Index 1: 0
     • Index 2: 0
     • Prečítajte si 2: 0
     • DÔLEŽITÉ: Je dôležité, aby bolo Read 1 nastavené na 24, inak celý beh zlyhá.
   • Ponechajte začiarkavacie políčko pre vlastné primery nezačiarknuté.
   • Nastavte umiestnenie výstupného priečinka pre aktuálne spustené nespracované údaje. Ak chcete zmeniť umiestnenie výstupného priečinka, vyberte Prehľadávať.
5. Nenastavujte Sample List.
6. Pre tento cyklus vyberte možnosť Vyčistiť spotrebný materiál.
7. Vyberte položku Ďalej.

Vložte prietokovú kyvetu do NextSeq™ 550

1. Odstráňte použitú prietokovú kyvetu z predchádzajúceho cyklu.
2. Umiestnite novú pripravenú prietokovú kyvetu na stage.
3. Vyberte Načítať. Dvere sa automaticky zatvoria.
4. Keď sa na obrazovke zobrazí ID prietokovej bunky a senzory sa skontrolujú zelenou farbou, vyberte Ďalej.

Vyprázdnite nádobu na činidlo

POZOR: Táto súprava činidiel obsahuje potenciálne nebezpečné chemikálie. Noste primerané ochranné prostriedky a použité reagencie zlikvidujte v súlade s platnými normami. Ďalšie informácie nájdete v príručke systému Illumina NextSeq 550.

1. Otvorte dvierka priehradky na pufre, vyberte nádobu s použitými činidlami zo spodnej priehradky a obsah zlikvidujte v súlade s platnými normami.
2. Zasuňte prázdnu nádobu s činidlom späť do spodnej priehradky na pufre. Počuteľné kliknutie signalizuje, že nádoba je správne umiestnená.

Naplňte zásobník vyrovnávacej pamäte

1. Vyberte použitú kazetu s pufrom z hornej priehradky na pufre a obsah zlikvidujte v súlade s platnými normami.
2. Zasuňte novú vložku pufra do hornej priehradky na tlmiaci roztok. Počuteľné kliknutie signalizuje, že kazeta je správne umiestnená. Uistite sa, že ID zásobníka vyrovnávacej pamäte sa zobrazuje na obrazovke a že senzory sú označené zelenou farbou.
3. Zatvorte dvierka vyrovnávacej priehradky a zvoľte Ďalej.

Vložte kazetu s činidlom

1. Otvorte dvierka reagenčného priestoru, vyberte použitú reagenčnú kazetu a nepoužitý obsah zlikvidujte v súlade s platnými normami. Zásobník v polohe 6 je odnímateľný, aby sa uľahčila bezpečná likvidácia.
2. Prepichnite tesnenie zásobníka č. 10 označeného ako „Load Library Here“ čistou špičkou 1 ml pipety.
3. Vložte 1.3 ml knižnice Olink zo skúmavky Seq do zásobníka č. 10 označeného ako „Load Library Here“.
4. Zasuňte novú reagenčnú kazetu do reagenčného priestoru a zatvorte dvierka reagenčného priestoru.
5. Zvoľte Load a počkajte ~30 sekúnd, kým sa na obrazovke nezobrazí ID kazety s činidlom a senzory sa skontrolujú zelenou farbou.
6. Z rozbaľovacieho zoznamu Recipe vyberte možnosť receptu [Custom] „Olink_NSQ550_HighOutput_V1“.
   • DÔLEŽITÉ: Uistite sa, že vlastný recept bol predtým nainštalovaný v prístroji. Pozri 2.2 Inštalácia vlastného receptu Olink®.
7. Vyberte položku Ďalej.

1. Potvrďte parametre chodu zobrazené na Review obrazovke. Ak chcete upraviť akékoľvek parametre, stlačením tlačidla Back sa vráťte na obrazovku Run Setup.
2. Vyberte položku Ďalej. Jazda sa spustí po automatickej kontrole pred spustením. Doba chodu sekvenovania je približne 7 h 30 min.
3. DÔLEŽITÉ: Uistite sa, že cyklus sa spustí po dokončení automatickej kontroly pred spustením (~5 minút).
   1. POZNÁMKAV prípade akýchkoľvek zlyhaní kontroly pred spustením si pozrite pokyny výrobcu.
   2. POZNÁMKA: Dávajte pozor, aby ste nenarazili alebo inak nenarušili NextSeq™ 550 počas sekvenovania. Prístroj je citlivý na vibrácie.
4. Vyčistite pracovný priestor.
   1. POZNÁMKA: Keď je sekvenovanie dokončené, softvér spustí automatické premývanie po spustení pomocou premývacích roztokov dodaných v náplni s pufrom a NaOCl v reagenčnej náplni. Toto umývanie trvá približne 90 minút. Po dokončení prania sa aktivuje tlačidlo Domov. Použité náplne a prietoková kyveta môžu byť ponechané na mieste až do ďalšieho cyklu.

Sledujte priebeh behu

Olink používa NGS ako výstup na kvantifikáciu množstva známej sekvencie s cieľom odhadnúť koncentráciu daného proteínu v samples (vo vzťahu k iným samples). Kvalita údajov z každého cyklu sekvenovania Explore je určená hlavne parametrami kontroly kvality jedinečnými pre technológiu Olink. Preto sú štandardné metriky kontroly kvality používané v konvenčných NGS, ako je Q-skóre, menej kritické.

História revízií

Verzia	Dátum	Popis
1.2	2022-11-01	1.2 Olink® Mydata bol nahradený Olink® NPX Explore. 2.4 Pridané 0.2 N k Skôr než začnete.
1.1	2021-12-13	Redakčné zmeny
1.0	2021-12-01	Nové

www.olink.com

Len na výskumné použitie. Nie je určené na použitie pri diagnostických postupoch.

Tento produkt obsahuje licenciu na nekomerčné používanie produktov Olink. Komerční používatelia môžu vyžadovať ďalšie licencie. Podrobnosti vám poskytne Olink Proteomics AB. Neexistujú žiadne záruky, vyjadrené alebo predpokladané, ktoré presahujú rámec tohto popisu. Olink Proteomics AB nezodpovedá za škody na majetku, osobné zranenia alebo ekonomické straty spôsobené týmto produktom. Nasledujúcu obchodnú značku vlastní Olink Proteomics AB: Olink®. Tento produkt je krytý niekoľkými patentmi a patentovými prihláškami dostupnými na https://www.olink.com/patents/.

© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Všetky ochranné známky tretích strán sú majetkom ich príslušných vlastníkov.
Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Švédsko
1192, v1.2, 2022-11-01

Dokumenty / zdroje

Olink NextSeq 550 Preskúmajte sekvenovanie [pdfPoužívateľská príručka NextSeq 550 Explore Sequencing, NextSeq 550, Explore Sequencing, Sequencing

Referencie

• Používateľská príručka