Používateľská príručka Olink NextSeq 2000 Explore Sequence

Obsah skryť

1 Olink NextSeq 2000 Explore Sequence

2 Úvod

6 Súvisiace príspevky

Olink NextSeq 2000 Explore Sequence

Poznámka k dokumentu
Používateľská príručka Olink® Explore, dokument č. 1153, je zastaraná a bola nahradená nasledujúcimi dokumentmi:

Olink® Explore Overview Používateľská príručka, dokument č. 1187
Používateľská príručka Olink® Explore 384, dokument č. 1188
Používateľská príručka Olink® Explore 4 x 384, dokument č. 1189
Používateľská príručka Olink® Explore 1536 & Expansion, dokument č. 1190

Používateľská príručka Olink® Explore 3072, dokument č. 1191
Olink® Explore Sequencing using NextSeq 550 User Manual, doc nr 1192
Olink® Explore Sequencing using NextSeq 2000 User Manual, doc nr 1193

Olink® Explore Sequencing using NovaSeq 6000 User Manual, doc nr 1194

Úvod

Zamýšľané použitie
Olink® Explore je platforma multiplexného imunotestu na objavovanie biomarkerov ľudského proteínu. Produkt je určený len na výskumné použitie a nie na použitie pri diagnostických postupoch. Laboratórne práce môžu vykonávať iba vyškolení pracovníci laboratória. Spracovanie údajov môže vykonávať iba vyškolený personál. Výsledky sú určené na použitie výskumníkmi v spojení s inými klinickými alebo laboratórnymi nálezmi.
O tejto príručke
Táto používateľská príručka poskytuje pokyny potrebné na sekvenovanie knižníc Olink® Explore Libraries na Illumina® NextSeq™ 2000. Pokyny sa musia striktne a jednoznačne dodržiavať. Akékoľvek odchýlky v priebehu laboratórnych krokov môžu viesť k zhoršeniu údajov. Pred spustením laboratórneho pracovného postupu si prečítajte Olink® Explore Overview Používateľská príručka pre úvod do platformy vrátane informácií o činidlách, potrebnom vybavení a dokumentáciiview pracovného postupu, ako aj laboratórnych smerníc. Pokyny, ako používať reagenčné súpravy Olink® Explore, nájdete v príslušnej používateľskej príručke Olink® Explore. Informácie o spracovaní údajov a analýze výsledkov sekvencie Olink® Explore nájdete v používateľskej príručke Olink® NPX Explore. Všetky ochranné známky a autorské práva obsiahnuté v tomto materiáli sú majetkom spoločnosti Olink® Proteomics AB, pokiaľ nie je uvedené inak.
Technická podpora
Pre technickú podporu kontaktujte Olink Proteomics na adrese podpora@olink.com.

Laboratórne pokyny

Táto kapitola poskytuje pokyny, ako sekvenovať knižnice Olink na NextSeq™ 2000 pomocou NextSeq™ 1000/2000 P2 reagencií (100 cyklov) v3. Protokol použitý na sekvenovanie je prispôsobením štandardného pracovného toku NGS Illumina® pre Illumina® NextSeq™ 2000.
Pred sekvenovaním sa uistite, že kvalita purifikovanej knižnice Olink bola overená. Pokyny na kontrolu kvality nájdete v príslušnej používateľskej príručke Olink Explore.
Naplánujte si sekvenčný chod
Jedna knižnica Olink môže byť sekvenovaná na prietokovú kyvetu NextSeq™ 2000 P2 a na jeden cyklus. Počet prietokových kyvet P2 a cyklov potrebných na sekvenovanie rôznych súprav reagencií Olink Explore je opísaný v tabuľke 1.
Ak je potrebný viac ako jeden cyklus, zopakujte pokyny popísané v tomto návode.
Tabuľka 1. Plánovanie chodu sekvenovania

Reagenčná súprava Olink® Explore	Počet knižníc Olink	Počet prietokových buniek a cyklov
Reagenčná súprava Olink® Explore 384	1	1
Reagenčná súprava Olink® Explore 4 x 384	4	4
Reagenčná súprava Olink® Explore 1536	4	4
Súprava expanzných činidiel Olink® Explore	4	4
Reagenčná súprava Olink® Explore 3072	8	8

Pripravte si vlastný recept Olink®
Počas tohto kroku sa na NextSeq™ 2000 pripraví vlastný recept Olink®. Tento krok je potrebné vykonať iba raz, a to pred prvým vykonaním sekvenovania Olink.
Rozbaľte a uložte vlastný recept Olink XML-file Olink_NSQ2K_P2_V1 v príslušnom priečinku prístroja.
POZNÁMKA: Vlastný recept Olink bude fungovať iba so súpravou NextSeq™ 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 kit a NextSeq™ 1000/2000 riadiacim softvérom v1.2 alebo v1.4.

Pripravte sekvenačné činidlá
Počas tohto kroku sa reagenčná kazeta obsahujúca klastrovacie a sekvenačné činidlá roztopí a pripraví sa prietoková kyveta.

POZOR: Kazeta s činidlom obsahuje potenciálne nebezpečné chemikálie. Noste primerané ochranné prostriedky a použité reagencie zlikvidujte v súlade s platnými normami. Ďalšie informácie nájdete v príručke systému Illumina NextSeq 1000 a 2000 (dokument č. 1000000109376).

Pripravte kazetu s činidlom
Rozmrazovanie neotvorenej náplne možno vykonať tromi rôznymi spôsobmi: pri izbovej teplote, v kontrolovanom vodnom kúpeli alebo v chladničke.

Pripravte lavicu

1 x NextSeq™ 1000/2000 P2 reagenčná kazeta (100 cyklov)

Pokyny
Rozmrazte kazetu s činidlom podľa popisu v tabuľke 2.
Tabuľka 2. Metódy rozmrazovania kazety s činidlom

Metóda rozmrazovania	Pokyny
Pri izbovej teplote	• Bez otvárania vrecka zo striebornej fólie položte zásobník so zmrazeným činidlom na stôl a nechajte ho rozmraziť pri izbovej teplote počas 9 hodín. Neprekračujte 16 hodín. • Uistite sa, že štítok vrecka smeruje nahor a že okolo kazety môže cirkulovať vzduch.
Vo vodnom kúpeli	• Bez otvárania vrecka zo striebornej fólie vložte kazetu so zmrazeným činidlom napoly ponorenú do vodného kúpeľa s kontrolovanou teplotou 25 °C a nechajte ju rozmraziť 6 hodín. Neprekračujte 8 hodín. • Uistite sa, že štítok vrecka smeruje nahor a že sa kazeta počas rozmrazovania neprevráti. • Náplň dôkladne osušte papierovou utierkou.
V chladničke	• Bez otvárania vrecka zo striebornej fólie položte náplň na stôl a nechajte ju rozmraziť pri izbovej teplote počas 6 hodín. • Uistite sa, že štítok vrecka smeruje nahor a že okolo kazety môže cirkulovať vzduch. • Dokončite rozmrazovanie náplne v chladničke počas 12 hodín. Neprekračujte 72 hodín. • Pred behom vyberte rozmrazenú neotvorenú náplň z chladničky a nechajte ju dosiahnuť izbovú teplotu aspoň 15 minút, ale nie dlhšie ako 1 hodinu.

POZNÁMKA: Rozmrazené náplne nie je možné opätovne zmraziť a musia sa uchovávať pri teplote 4 °C, maximálne 72 hodín.

Pripravte prietokovú kyvetu Pripravte lavicu

1x prietoková bunka NextSeq™ 1000/2000 P2

Pokyny

Nechajte chladenú prietokovú kyvetu priviesť na izbovú teplotu na 10-15 minút.

Pripravte Olink® Library na sekvenovanie

Počas tohto kroku sa purifikovaná a kvalitatívne kontrolovaná knižnica Olink riedi na konečnú nanášaciu koncentráciu. Upozorňujeme, že denaturácia knižnice sa vykonáva automaticky na palube prístroja.
Pripravte lavicu

Lib Tube, pripravená podľa príslušnej používateľskej príručky Olink Explore

1x RSB s Tween 20
MilliQ voda
2x mikrocentrifugačné skúmavky (1.5 ml)
Ručná pipeta (10, 100 a 1000 μl)
Filtrujte špičky pipiet

Skôr ako začnete

Rozmrazte Lib Tube, ak je zmrazená.
Zmrazené RSB rozmrazte pomocou Tween 20 pri izbovej teplote počas 10 minút. Do použitia uchovávajte pri +4 °C.
Označte dve nové 1.5 ml mikrocentrifugačné skúmavky nasledovne:
- Označte jednu skúmavku „Dil“ (pre knižnicu zriedenú v pomere 1:100)
- Označte jednu skúmavku „Seq“ (pre knižnicu pripravenú na načítanie)

Pokyny

Pridajte 495 μl vody MilliQ do skúmavky Dil.

Vortexujte Lib Tube a krátko ju otočte.
Manuálne preneste 5 μl z Lib Tube do Dil Tube.
Vortexujte Dil Tube a krátko ju otočte.
Pridajte 20 μl RBS s Tween 20 do skúmavky Seq.

Manuálne preneste 20 μl z Dil Tube do Seq Tube.
Vortexujte Seq Tube a krátko otočte.
Okamžite pokračujte bodom 2.5 Vložte prietokovú kyvetu a knižnicu Olink® do kazety s činidlom. POZNÁMKA: Skladujte skúmavku(y) Lib pri teplote -20 °C pre prípad možného opätovného spustenia.

Vložte prietokovú kyvetu a knižnicu Olink® do kazety s činidlom
Počas tohto kroku sa prietoková kyveta a zriedená knižnica Olink vložia do rozmrazenej kazety s činidlom.
Pripravte lavicu

1x rozmrazená kazeta s reagentom NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 cyklov), pripravená v predchádzajúcom kroku

1x prietoková bunka NextSeq™ 1000/2000 P2, pripravená v predchádzajúcom kroku
Sex Tube (so zriedenou knižnicou Olink Library pripravenou na načítanie), pripravenou v predchádzajúcom kroku

Ručná pipeta (100 μl)
Pipetová špička (1 ml)

Pripravte kazetu

Vyberte kazetu zo strieborného fóliového vrecka.
Desaťkrát prevráťte kazetu, aby sa rozmrazené činidlá dôkladne premiešali.

POZNÁMKA: Je normálne počuť cinkanie vnútorných komponentov.

Vložte prietokovú kyvetu do náplne

Keď budete pripravení vložiť prietokovú kyvetu do náplne, vyberte prietokovú kyvetu z obalu. Uchopte prietokovú kyvetu za sivú úchytku tak, aby štítok na úchytke smeroval nahor. Používajte nové rukavice bez púdru, aby ste zabránili kontaminácii skleneného povrchu prietokovej kyvety.
Vložte prietokovú kyvetu do otvoru prietokovej kyvety v prednej časti náplne. Počuteľné kliknutie signalizuje, že prietoková kyveta je správne umiestnená.
Odstráňte sivú úchytku vytiahnutím.

Vložte Olink® Library do kazety

Prepichnite nádržku Library čistou 1 ml špičkou pipety.
Naplňte 20 μl knižnice Olink zo skúmavky Seq do spodnej časti zásobníka knižnice.

Vykonajte sekvenovanie Olink®
Počas tohto kroku sa do zariadenia NextSeq™ 2000 vloží zásobník pufra s naloženou prietokovou kyvetou a knižnicou Olink a spustí sa sekvenovanie pomocou receptu Olink.
Pripravte lavicu

1 x NextSeq™ 1000/2000 P2 reagenčná kazeta (100 cyklov) naplnená prietokovou kyvetou NextSeq™ 1000/2000 P2 a zriedenou knižnicou Olink, pripravenou v predchádzajúcom kroku.

Nakonfigurujte režim chodu

V ponuke ovládacieho softvéru vyberte položku Nastavenia.
V časti BaseSpace Sequence Hub Services & Proactive Support vyberte Local Run Setup.
Ako ďalšie nastavenia vyberte možnosť Len proaktívna podpora. Táto funkcia vyžaduje internetové pripojenie.
Vyberte umiestnenie hostiteľa pre svoje údaje. Miesto hostiteľa by malo byť vo vašom regióne alebo blízko neho.
Nastavte umiestnenie výstupného priečinka pre aktuálne spustené nespracované údaje. Vyberte položku Vybrať na navigáciu a vyberte výstupný priečinok.
Začiarknutím políčka Denature and Dilute On Board sa automaticky denaturuje a riedi knižnica na palube prístroja.
Začiarknutím políčka Purge Reagent Cartridge (Vyčistiť kazetu s činidlami) automaticky vyprázdnite nepoužité činidlá do priehradky na použité činidlá v kazete.
Ak chcete automaticky kontrolovať aktualizácie softvéru (voliteľné), začiarknite políčko Automaticky kontrolovať aktualizácie softvéru. Táto funkcia vyžaduje internetové pripojenie.
Vyberte možnosť Uložiť.

Nastavte parametre chodu

POZNÁMKA: Tento pokyn platí pre verziu 1.4 ovládacieho softvéru NextSeq™ 1000/2000. Niektoré z krokov popísaných nižšie sa môžu pri použití verzie v1.2 líšiť

V ponuke ovládacieho softvéru vyberte položku Štart.
Vyberte možnosť Manually Set Up New Run a stlačte tlačidlo Setup.
Na stránke Run Setup nastavte parametre chodu nasledovne:

Do poľa Run Name zadajte jedinečné ID experimentu.
V rozbaľovacom zozname Typ čítania vyberte možnosť Jedno čítanie.

Zadajte počet cyklov takto:

- Prečítajte si 1: 24
- Index 1: 0
- Index 2: 0
- Prečítajte si 2: 0

POZNÁMKA: Je dôležité, aby bolo Read 1 nastavené na 24, inak celý beh zlyhá.
POZNÁMKA: Pri zadávaní počtu cyklov ignorujte varovné hlásenia.

V rozbaľovacom zozname Custom Primer Wells vyberte No.
V poli Vlastný recept (voliteľné) vyberte položku Vybrať na navigáciu a vyberte XML vlastného receptu file Olink_NSQ2K_P2_V1. Vyberte možnosť Otvoriť.

Neimportujte Sample List.
Uistite sa, že umiestnenie výstupného priečinka je správne. V opačnom prípade vyberte možnosť Vybrať na navigáciu a vyberte požadované umiestnenie výstupného priečinka.
V poli Denature and Dilute Onboard vyberte z rozbaľovacieho zoznamu možnosť Enabled.
Vyberte položku Príprava.

Vložte vloženú kazetu

Vyberte Načítať. Otvorí sa priezor prístroja a podnos sa vysunie.

Vložte naplnenú kazetu na tácku štítkom nahor a prietokovou kyvetou vo vnútri prístroja.
Vyberte možnosť Zavrieť.
Keď je kazeta správne vložená, skontrolujte parametre cyklu a vyberte položku Sekvencia. Prístroj vykonáva predbežné kontroly prístroja a tekutín.
POZNÁMKA: Počas kontroly tekutín sa očakáva, že budete počuť niekoľko pukavých zvukov.
Uistite sa, že beh začne po dokončení automatických kontrol pred spustením (~15 minút). Doba chodu sekvenovania je približne 10 h 30 min.
POZNÁMKA: V prípade akýchkoľvek zlyhaní kontroly pred spustením si pozrite pokyny výrobcu.
POZNÁMKA: Dávajte pozor, aby ste nenarazili alebo inak nenarušili NextSeq™ 2000 počas sekvenovania. Prístroj je citlivý na vibrácie.

Vyčistite pracovný priestor.

Monitorujte priebeh chodu
Olink používa NGS ako výstup na kvantifikáciu množstva známej sekvencie s cieľom odhadnúť koncentráciu daného proteínu v samples (vo vzťahu k iným samples). Kvalita údajov z každého cyklu sekvenovania Explore je určená hlavne parametrami kontroly kvality jedinečnými pre technológiu Olink. Preto sú štandardné metriky kontroly kvality používané v konvenčných NGS, ako je Q-skóre, menej kritické.
Po cykle vysuňte a zlikvidujte kazetu

POZOR: Táto súprava činidiel obsahuje potenciálne nebezpečné chemikálie. Noste primerané ochranné prostriedky a použité reagencie zlikvidujte v súlade s platnými normami. Ďalšie informácie nájdete v príručke systému Illumina NextSeq 1000 a 2000 (dokument č. 1000000109376).

Po dokončení cyklu vyberte možnosť Vysunúť kazetu.
POZNÁMKA: Použitá náplň vrátane prietokovej kyvety môže byť ponechaná na mieste až do ďalšieho cyklu, ale nie dlhšie ako 3 dni.

Vyberte kazetu zo zásobníka.
Reagencie zlikvidujte v súlade s platnými normami.
Vyberte možnosť Zavrieť dvere. Zásobník je znovu vložený.
Výberom položky Domov sa vrátite na domovskú obrazovku.
POZNÁMKA: Pretože kazeta obsahuje všetky mechanizmy na spustenie systému, ako aj zásobník na zhromažďovanie použitých činidiel, nie je potrebné umývanie nástroja po spustení.

História revízií

Verzia	Dátum	Popis
1.1	2022-11-01	1.2 Olink® Mydata bol nahradený Olink® NPX Explore. 2.2 Upravené.
1.0	2021-12-01	Nové

www.olink.com
Len na výskumné použitie. Nie je určené na použitie pri diagnostických postupoch.
Tento produkt obsahuje licenciu na nekomerčné používanie produktov Olink. Komerční používatelia môžu vyžadovať ďalšie licencie. Podrobnosti vám poskytne Olink Proteomics AB. Neexistujú žiadne záruky, vyjadrené alebo predpokladané, ktoré presahujú rámec tohto popisu. Olink Proteomics AB nezodpovedá za škody na majetku, osobné zranenia alebo ekonomické straty spôsobené týmto produktom.

Nasledujúcu ochrannú známku vlastní Olink Proteomics AB: Olink®.
Tento produkt je chránený niekoľkými patentmi a patentovými prihláškami dostupnými na https://www.olink.com/patents/.

© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Všetky ochranné známky tretích strán sú majetkom ich príslušných vlastníkov. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Švédsko 1193, v1.1, 2022-11-01